Einfluss von Niedrigdosisstrahlung auf die Leukämieentwicklung bei genetischer Prädisposition in einem Mausmodell

Leukämieentwicklung bei Niedrig-Dosis-Strahlung im genetisch prädisponierten Mausmodell

Ionisierende Strahlung ist ein bekannter Risikofaktor für die Leukämie‐Entstehung im Kindesalter. Allerdings ist die Bedeutung schwacher ionisierender Strahlung im Niedrigdosisbereich noch unklar. Das Deutsche Kinderkrebsregister in Mainz führte im Auftrag des Bundesamtes für Strahlenschutz von 2003 bis 2007 die Studie "Kinderkrebs in der Umgebung von Kernkraftwerken" (KiKK‐Studie) durch und konnte eine Korrelation zwischen der Nähe des Wohnortes zu einem Kernkraftwerk und dem Risiko eine Leukämie zu entwickeln aufzeigen. Dies lässt sich jedoch mit dem derzeitigen wissenschaftlichen Kenntnisstand über Strahlenwirkungen nicht erklären. Für den Strahlenschutz ist es notwendig zu untersuchen, ob Personen mit genetischer Prädisposition einem besonderen Risiko gegenüber ionisierender Strahlung ausgesetzt sind.

Bei Kindern, die eine Leukämie entwickeln, ist bekannt, dass oft eine genetische Prädisposition vorliegt und wahrscheinlich nur eine weitere genetische Mutation zur Krankheitsentwicklung ausreicht. Eine der häufigsten genetischen Prädispositionen bei Kindern ist die Translokation ETV6‐RUNX1, die bereits im Mutterleib entsteht. Ziel des Forschungsvorhabens war es, experimentell im Mausmodell zu prüfen, ob genetische Faktoren die Empfindlichkeit für den schädlichen Einfluss ionisierender Strahlung beeinflussen.

Zielsetzung

In diesem Projekt sollte das Sca1‐ETV6‐RUNX1‐Mausmodell, das die häufigste bei Kindern beschriebene präleukämische Gentranslokation ETV6‐RUNX1 trägt, eingesetzt werden, um zu testen, ob die Exposition mit Niedrigdosisstrahlung Mutationsereignisse in Krebsgenen verändern kann und damit die Leukämieentwicklung beeinflusst. Die Leukämieentwicklung nach Bestrahlung sollte beobachtet und die sich entwickelnden Leukämien phänotypisch charakterisiert werden.

Die genetischen Veränderungen in den auftretenden Leukämien der Mäuse sollten nach Strahlenexposition erfasst, mit Leukämien von Schein-exponierten Mäusen verglichen und auf strahlungsbedingte Mutationsmuster hin untersucht werden. Die Ergebnisse sollten mit publizierten, sekundären genomischen Veränderungen der murinen und der humanen ETV6‐RUNX1‐positiven‐pB‐ALL verglichen werden, um genomischen Veränderungen als Folge von niedrigdosierter Bestrahlung erfassen zu können, die spezifisch mit der ETV6‐RUNX1‐Prädisposition assoziiert sind.

Methodik

Zunächst wurden Online‐Literaturrecherchen (Pubmed‐Datenbank) zum aktuellen Stand der Wissenschaft durchgeführt und die geplante experimentelle Vorgehensweise geprüft.

Dann wurden genetisch prädisponierte Sca1‐ETV6‐RUNX1‐Mäuse (jeweils n=30 pro Behandlung) einmalig mit definierten Dosen bis in den Niedrigdosisbereich (2 Gy, 0,5 Gy, 50 mGy) bestrahlt bzw. scheinbestrahlt. Das Auftreten von Leukämien wurde bis zu einem Alter der Tiere von zwei Jahren erfasst und auftretende Tumore phänotypisch und genotypisch untersucht.

Durchführung

Gruppen von jeweils 30 Sca1‐ETV6‐RUNX1‐Mäusen wurden einmalig mit den Dosen 2 Gy, 0,5 Gy und 50 mGy mittels einer geschlossenen, kalibrierten Gammastrahlenquelle (Cs-137, Gammacell 1000 Elite, nominale Aktivität 12,8 TBq) bestrahlt bzw. zur Kontrolle scheinbestrahlt (0 Gy). Die Tiere wurden bis zu einem Alter von zwei Jahren regelmäßig durch Blutkontrollen auf das Vorliegen von Leukämien untersucht. Tiere, die Merkmale einer Leukämie aufwiesen, wurden getötet und den üblichen Nekropsieverfahren unterzogen. Makroskopisch, histologisch, durchflusszytometrisch und molekularbiologisch wurden Gewebeinfiltration, Tumor‐Zellzahl und Tumor‐Klonalität in hämatopoetischen Organen untersucht.

Zur Durchführung der Gesamt‐Exom‐Sequenzierung von leukämischen Zellen wurde die Tumor‐DNA aus dem leukämischen Gewebe (Knochenmark, Lymphknoten oder Milz) in den erkrankten Mäusen isoliert und aufgereinigt. Aus der Schwanzspitze der jeweiligen Maus wurde DNA als Referenz‐Keimbahnmaterial extrahiert. Die Exom‐Bibliotheken wurden mit Hilfe des Agilent SureSelectXT Mouse All Exon Kits durchgeführt. Die Sequenzierung der Bibliothek wurde auf der NextSeq550‐Plattform (Illumina) durchgeführt.

Für die Datenanalyse wurden zunächst Fastq‐Dateien mit Bcl2Fastq 1.8.4 (Illumina) erzeugt. Die BWA‐Version 0.7.4. wurde verwendet, um die erhaltenen Sequenzdaten an das Mausreferenzgenom (GRCm38.71) zu alignieren. Konvertierungsschritte wurden mit Samtools durchgeführt, gefolgt von der Entfernung von PCR‐Duplikaten mittels Picard. Der Sequenzvergleich mittels lokalem Verfahren bei kleinen Insertionen/Deletionen ("Indels", < 50 bp), das Calling von somatischen Einzelnukleotidvariationen (single nucleotide variants, SNV), die Annotierung und die Rekalibrierung wurden mit Hilfe von GATK 2.4.9 durchgeführt. Die identifizierten Varianten wurden mit dem Variant Effect Predictor (VEP) unter Verwendung der Ensembl‐Datenbank (v70) annotiert.

Zusätzlich wurden Scores der Softwaretools SIFT und Polyphen hinzugefügt, die einen potentiellen Funktionsverlust der betroffenen Gene/Proteine vorhersagen. Gene, die in ursächlichem Zusammenhang mit Krebs bekannt sind, wurden mittels der Genliste des Cancer Gene Consensus (CGC, COSMIC Datensatz) identifiziert. Zur Analyse der Mutationssignaturen wurden die Exom‐Daten einem standardisierten Alignment unterzogen. Nach mehreren Vorverarbeitungsschritten wurden Einzelnukleotidvarianten für die pB‐ALL‐Proben der bestrahlten Sca1‐ETV6‐RUNX1‐Mäuse sowie für Kontrollproben (Infektions‐getriggerte pB‐ALL‐Proben von nicht bestrahlten sca1‐ETV6‐ RUNX1‐Mäusen) mit Platypus Version 0.8.1 und Standardparametern bestimmt. Mutationssignaturanalysen wurden anschließend mit dem R/Bioconductor‐Paket MutationalPatterns, Version 1.6.169, durchgeführt. Die Mutationssignaturen Version 3.2 im COSMIC Release v93 wurden für die Analysen verwendet.

Ergebnisse

Mit einem Sca1‐ETV6‐RUNX1-Mausmodell, das die häufigste bei Kindern anzutreffende Gentranslokation ETV6‐RUNX1 trägt und deren Auswirkung dem Menschen sehr ähnlich ist, konnte nun die Wirkung von ionisierender Strahlung im mittleren (0,5 und 2 Gy) und niedrigen Dosisbereich (0,05 Gy) untersucht werden. Im mittleren Dosisbereich entwickelten etwa 10 % von 30 Tieren eine Leukämie. Vorläufer‐B‐Zell akute lymphatische Leukämien (pB‐ALL) entstanden bei Sca1‐ETV6‐RUNX1‐Mäusen, die im Alter von vier Wochen einmalig mit einer Dosis von mindestens 0,5 Gy mittels einer Gammastrahlenquelle (Cs‐137) bestrahlt wurden (0,5 Gy, n=3/30; 2 Gy, n=4/30). Expositionsbedingte somatische Mutationen in diesen pB‐ALL betrafen (1) Hot‐Spot‐Regionen in bekannten Krebsgenen (Jak1, Jak3, Ptpn11, Kras), (2) Gene, die auch in humaner ETV6‐RUNX1‐positiver pB‐ALL mutiert waren (Atm, Sh2b3, Ptpn11, Kras), (3) ALL‐Prädispositionsgene (Sh2B3, Ptpn11), (4) andere bekannte Krebsgene. Aufgrund der geringen Zahl an Tumoren und somatischen Einzelnukleotidvariationen konnte keine spezifische strahleninduzierte Mutationssignatur identifiziert werden.

In einer Gruppe von 30 Mäusen konnte im Niedrigdosisbereich (0,05 Gy) keine Leukämie ausgelöst werden.

Größere Gruppen oder Mausmodelle mit einer höheren Tumorentstehung könnten zukünftig zusammen mit Ganz‐Genom‐Sequenzierung und ergänzenden Omics‐Analysen größere Datensätze generieren und ein umfassendes Bild von spezifischen t(12;21)‐assoziierten sekundären, genomischen Veränderungen als Folge von Bestrahlung liefern.